賽默飛StepOne實(shí)時熒光定量PCR儀的操作使用方法的詳細(xì)指南。內(nèi)容涵蓋了從實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備到數(shù)據(jù)分析的完整流程，并強(qiáng)調(diào)了關(guān)鍵注意事項(xiàng)。

一、賽默飛StepOne實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1、儀器與試劑準(zhǔn)備

儀器：確保StepOne PCR儀電源穩(wěn)定，電腦已連接并安裝了StepOne Software。

耗材：選擇兼容的PCR反應(yīng)板或八聯(lián)管（如Applied Biosystems™ MicroAmp™系列）和光學(xué)蓋膜。

試劑：準(zhǔn)備好您的qPCR預(yù)混液、引物/探針、模板DNA/cDNA和無核酸酶水。

2、反應(yīng)體系配制（在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）

總體積：通常為20μL或10μL。

建議：配制一個主混合液，然后分裝到各反應(yīng)孔，最后加入模板，以減少加樣誤差和污染。

對照設(shè)置：

無模板對照：用水代替模板，用于檢測試劑污染。

陽性對照：使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)有效性。

3、上樣與封膜

將配制好的反應(yīng)體系小心加入到反應(yīng)板或八聯(lián)管中，避免產(chǎn)生氣泡。

使用光學(xué)透明蓋膜密封反應(yīng)板。確保蓋膜緊密貼合，無褶皺，防止蒸發(fā)和交叉污染。

二、賽默飛StepOne實(shí)時熒光定量PCR上機(jī)運(yùn)行

1、啟動軟件與放置樣品

打開電腦，啟動 StepOne Software。

打開StepOne PCR儀艙門，將密封好的反應(yīng)板放入儀器樣品槽中，確保板子放置方向正確（A1孔在左上角）。

關(guān)閉艙門。

2、創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)

在軟件主界面，點(diǎn)擊 "New Experiment"（新建實(shí)驗(yàn)）。

3、設(shè)置實(shí)驗(yàn)類型

在 "Setup" 選項(xiàng)卡下，選擇實(shí)驗(yàn)類型：

Quantitation (Standard Curve)：定量，需要運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)品來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Comparative Ct (ΔΔCt)：相對定量，常用，用于分析基因的表達(dá)差異。

Melt Curve：熔解曲線，通常在SYBR Green實(shí)驗(yàn)后運(yùn)行，用于檢查擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

Allelic Discrimination：基因分型。

4、編輯樣品孔布局

點(diǎn)擊 "Plate" 選項(xiàng)卡。

在虛擬的反應(yīng)板界面上，用鼠標(biāo)選擇孔位，然后右鍵或使用左側(cè)工具欄定義其屬性：

樣品類型：未知、陽性對照、陰性對照、標(biāo)準(zhǔn)品。

樣品名稱：如"Sample 1"，"Control"等。

目標(biāo)基因：為每個孔指定檢測的基因（如GAPDH， Target Gene）。軟件允許在同一塊板上進(jìn)行多基因檢測。

重復(fù)：設(shè)置技術(shù)重復(fù)。

5、運(yùn)行實(shí)驗(yàn)

檢查所有設(shè)置無誤后，點(diǎn)擊軟件右上角的 "Start Run"（開始運(yùn)行）按鈕。

輸入實(shí)驗(yàn)名稱和保存路徑。

儀器將開始運(yùn)行，您可以在軟件界面上實(shí)時查看擴(kuò)增曲線和溫度狀態(tài)。

三、日常維護(hù)

1、清潔：定期用70%乙醇和無塵紙清潔樣品槽表面。

2、校準(zhǔn)：根據(jù)儀器提示或定期進(jìn)行光學(xué)校準(zhǔn)。

3、記錄：記錄每次使用情況和任何異常。