賽默飛QuantStudio1實時熒光定量PCR（qPCR）儀支持多種熒光檢測方法，其核心原理基于染料法（如SYBR Green）和探針法（如TaqMan），通過熒光信號的變化實時監測PCR擴增過程，從而實現對目標核酸的定量分析。以下是其試劑和染料的工作原理：

一、染料法（SYBR Green）

1、原理：

SYBR Green是一種可嵌入DNA雙鏈小溝的熒光染料，在游離狀態下幾乎不發光，但一旦與雙鏈DNA（dsDNA）結合，熒光信號增強約1000倍。

2、特點：

優點：成本低，適用于任何PCR產物（無需特異性探針）。

缺點：會結合所有雙鏈DNA（包括引物二聚體和非特異性產物），需通過熔解曲線分析（HRM）驗證擴增特異性。

3、QuantStudio1適配性：

已校準支持FAM/SYBR Green I通道（激發/發射波長：~497/520 nm）。

二、探針法（TaqMan）

1、原理：

TaqMan探針是一種寡核苷酸，5′端標記報告熒光基團（如FAM、VIC），3′端標記淬滅基團（如TAMRA）。

當探針完整時，熒光基團的信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性切割探針，使熒光基團與淬滅基團分離，釋放熒光信號。

2、特點：

優點：特異性高（僅靶序列擴增時產生信號），支持多重檢測（不同探針標記不同熒光基團）。

缺點：探針合成成本較高。

3、QuantStudio1適配性：

支持FAM、VIC、ROX等熒光通道，可同時檢測3種靶標（如FAM/VIC/ROX三通道檢測）。

三、被動參照染料（ROX校正）

作用：

ROX是一種不與DNA結合的熒光染料，用于校正孔間差異（如加樣誤差、耗材透光度差異）。

QuantStudio1內置ROX校準功能，提高數據準確性。

四、熒光檢測系統

QuantStudio1采用：

白光LED光源（寬光譜激發）和 CMOS成像系統，實現96孔同步檢測，避免逐孔掃描的時間誤差。

濾光片配置：FAM、VIC、ROX三通道，覆蓋常見熒光染料需求。

五、總結

QuantStudio1通過染料法和探針法實現高靈敏度（可檢測1.5倍差異）和多重檢測（3通道），結合ROX校正和同步成像技術，確保數據精準可靠。用戶可根據實驗需求選擇SYBR Green（經濟通用）或TaqMan探針（高特異性多重檢測）。